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酶聯(lián)免疫吸附測定實驗(ELISA)的操作流程
Elisa 操作流程(以人IL-4 ELISA KIT為例)：
檢測原理:
本實驗采用雙抗體夾心ELISA法。抗人IL-4單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-4會 與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親 和素。生物素與親和素特異性結(jié)合;抗人IL-4抗體與結(jié)合在單抗上的人IL-4結(jié)合而形成免疫 復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有IL-4，辣根過氧化物酶會使無色 的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，IL-4濃度與OD450值之間呈正比，可 通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-4的濃度。
試劑盒組成：
1.抗體預(yù)包被酶標(biāo)板(8×12 或 8×6)
2.凍干標(biāo)準(zhǔn)品(2 / 1 支;0.5ng/支)
3.標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液(橙蓋瓶)(1 瓶;20ml/12ml)
4.濃縮生物素化抗體(紫蓋瓶)(1 支)
5.生物素化抗體稀釋液(藍(lán)蓋瓶)(1 瓶;16ml/10ml)
6.濃縮酶結(jié)合物(棕蓋瓶)(1 支)
7.酶結(jié)合物稀釋液(紫蓋瓶)(1 瓶;16ml/10ml)
8.濃縮洗滌液 20× (白蓋瓶)(1 瓶;50ml/25ml)
9.顯色底物(TMB)(棕蓋瓶)(1 瓶;12ml/6ml)
10.反應(yīng)終止液(紅蓋瓶)(1 瓶;12ml/6ml)
11.封板膠紙(6/3 張)
12.產(chǎn)品說明書(1 份)
酶聯(lián)免疫試劑盒標(biāo)本收集:
1. 收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。
2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。
3. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
4. 標(biāo)本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-70℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，3-6月內(nèi)檢測。
5. 如果您的樣本中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建 議做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù))。
酶聯(lián)免疫試劑盒 注意事項:
1. 試劑盒使用前請保存在2-8℃。復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)分裝后，將其放在-20～-70℃貯存。
2. 濃縮生物素化抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運(yùn)輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁 或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。
3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正常現(xiàn)象，微加熱至40℃使結(jié)晶溶解后 再配制洗滌液。(加熱溫度不要超過50℃)使用時洗滌液應(yīng)為室溫。
4. 若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分裝，將其放在-20～-70℃貯存。避免反復(fù)凍 融。
5. 不同批號的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應(yīng)終止液除外)。
6. 充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。
7. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。
8. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁在不同的液體之間混用!否則將影響試 驗結(jié)果。
9. 試驗中請穿著試驗服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測血液或者其他體液標(biāo)本時， 請按國家生物試驗室安全防護(hù)條列執(zhí)行。
檢測前準(zhǔn)備工作:
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:20)。未用完的放回4℃。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液0.5ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為1000 pg/ml)。然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。(建議標(biāo)準(zhǔn)曲線使用以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品原液(1000 pg/ml)若未用完請分裝后放入-20℃以下電冰箱內(nèi)保存，保存兩個月。已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品請廢棄。
4. 生物素化抗體工作液：按當(dāng)次試驗所需要得用量，使用前20分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:30)成工作濃度。當(dāng)日使用。若實驗次數(shù)過多導(dǎo)致生物素化 抗體量不足，可向我們公司單獨購買生物素化抗體。(須提供抗體批號)
5. 酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次試驗所需要得用量，使用前20分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃 縮酶結(jié)合物(1:30) 成工作濃度。當(dāng)日使用。若實驗次數(shù)過多導(dǎo)致濃縮酶結(jié)合物量不足， 可向我們公司單獨購買濃縮酶結(jié)合物。(須提供酶結(jié)合物批號)
酶聯(lián)免疫試劑盒洗滌方法:
1. 自動洗板機(jī)：要求注入的洗滌液為350ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350ul，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。
操作步驟:
1.從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)壓 實自封條，密封口袋，放回4℃。
2.空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育90分鐘。
3.提前20分鐘準(zhǔn)備生物素化抗體工作液。
4.洗板5次。
5.空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育60分鐘。
6.提前20分鐘準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫(22-25 ) ℃ 放置。
7.洗板5次。
8.空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱，避光孵育30分鐘。
9.打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。
10.洗板5次。
11.加入顯色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分鐘。
12.加入終止液100ul/孔, 混勻后即刻測量OD450值(3分鐘內(nèi))。在儀器保存讀數(shù)結(jié)果并打印一份紙質(zhì)結(jié)果。
13.實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結(jié)束。
建議保存酶標(biāo)板框，以備下次或者今后試驗使用。
結(jié)果判斷:
1. 每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值。
2. 手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。
3. 若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
靈敏度、特異性和重復(fù)性:
● 靈敏度：最小可測人IL-4達(dá)7pg/ml。
● 特異性：不與IL-1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反應(yīng)。
● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。
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