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標(biāo)簽：熒光定量 PCR PCR 試劑  實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 耗材 

所謂實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù) ，是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCR 進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。以下便是天津本生生物就熒光定量 PCR 原理的簡要說明，一起來看下：

檢測方法：

1.SYBRGreenⅠ法：在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加*同步。SYBR 定量 PCR 擴(kuò)增熒光曲線圖 PCR 產(chǎn)物熔解曲線圖 (單一峰圖表明 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性)

2.TaqMan 探針法：探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR 擴(kuò)增時(shí)，Taq 酶的 5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物的形成*同步。

1. 熒光閾值 (threshold) 的設(shè)定 PCR 反應(yīng)的前 15 個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省 (默認(rèn)) 設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct 值與起始模板的關(guān)系每個(gè)模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。Ct =-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n 為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0 為初始模板量，Ex 為擴(kuò)增效率，N 為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代 Ct 值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：

1. TaqMan 熒光探針：PCR 擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR 擴(kuò)增時(shí)，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成*同步。而新型 TaqMan-MGB 探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變 (SNP)，有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的當(dāng)選技術(shù)平臺。

2. SYBR 熒光染料：在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料非特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加*同步。SYBR 僅與雙鏈 DNA 進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定 PCR 反應(yīng)是否特異。

3. 分子信標(biāo)：是一種在 5 和 3 末端自身形成一個(gè) 8 個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR 產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定 DNA 序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

1. 傳統(tǒng)定量 PCR 方法簡介：

1) 內(nèi)參照法：在不同的 PCR 反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在 PCR 產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

2) 競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增 (其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化 PCR 產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。3)PCR-ELISA 法：利用 digaoxin 或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗 digaoxin 或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的 PCR-ELISA 法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

2. 內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測，即 PCR 到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測，而 PCR 經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時(shí)，檢測重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在 96 孔 PCR 儀上做 96 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3. 內(nèi)標(biāo)對定量 PCR 的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則 PCR 反應(yīng)變?yōu)殡p重 PCR，雙重 PCR 反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品 Ct 值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。

因此，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1)Ct 值的重現(xiàn)性 PCR 循環(huán)在到達(dá) Ct 值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期 (對數(shù)期)，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此 Ct 值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的 Ct 值是恒定的。

2)Ct 值與起始模板的線性關(guān)系由于 Ct 值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。 各級各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。由于 qPCR 是實(shí)時(shí)定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu) 

產(chǎn)品優(yōu)勢：
本生生物代理實(shí)驗(yàn)室耗材,PCR 耗材品種全，可替代儀器原廠耗材，性價(jià)比高，質(zhì)量穩(wěn)定，對用戶可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

適應(yīng)客戶：
醫(yī)院檢驗(yàn)科 PCR 實(shí)驗(yàn)室，中心實(shí)驗(yàn)室，肝病中心；第三方檢測機(jī)構(gòu)，科研院所，大專院校，制藥廠，試劑生產(chǎn)廠家，疾控中心，檢驗(yàn)檢疫。

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